La riserva si estende per gran parte sui territori di Ferla e Sortino su cui si trovano la maggior parte delle catacombe. È attraversata dal fiume Anapo che scorre attraverso i canyon a "V" caratteristici della zona.

Per quanto riguarda l’aspetto naturalistico, la riserva di Pantalica offre ambienti ecologici diversificati che consentono l’espressione di una biodiversità significativa. Abbiamo diversi biotipi a seconda degli ambienti: un acquatico, uno ripariale (delle pareti), uno della valle, dei pianori e delle grotte. Lungo il corso del fiume si sviluppa una crescente vegetazione a platano orientale. Sulle rocce invece vi è la presenza di oleandri, perfettamente adatti a questo clima. Tra gli alberi dominano i salici, il pioppo nero, l’orniello, il carpino e la roverella, mentre il sottobosco diventa intricato a causa dei rovi e delle piante lianose come la vitalba. Arbusti del sottobosco sono anche il pungitopo, il biancospino, il lentisco e l’euforbia cespugliosa. Come fiori sono presenti ciclamini, margheritine di campo, fiorellini bianchi dell’aglio selvatico e il ranuncoli dalla corona gialla. Spostandoci verso le pareti della valle vi è la presenza della macchia mediterranea costituita da sempreverdi quali il leccio, il terebinto, la fillirea e l’alaterno.

L’ambiente fluviale di natura torrentizia offre un’habitat ideale alla rara trota siciliana (Salmo trutta macrostigma), presente in altre pochissime stazioni in Sicilia , alla trota fario (Salmo trutta fario) e alla tinca (Tinca tinca). Non è raro trovare anche l’anguilla (Anguilla anguilla) e il granchio di fiume (Potamon fluviatile).

Dei numerosi uccelli rapaci che un tempo popolavano quest’area sopravvivono solo il falco pellegrino (Falco peregrinus) e qualche raro esemplare dell’aquila del Bonelli (Hieraaetus fasciatus), che si nutrono di conigli (Oryctolagus cuniculus) e coturnici (Alectoris graeca), specie queste presenti tra la bassa vegetazione dei pendii. Tra le altre specie ornitologiche presenti merita un cenno l’upupa (Upupa epops).

Altri mammiferi presenti sono la volpe (Vulpes vulpes), la martora (Martes martes), la donnola (Mustela nivalis) e l’istrice (Hystrix cristata). Nella grotta dei Pipistrelli e nella grotta Trovato trovano inoltre ospitalità numerose specie di pipistrelli.

Variegato e ricco il regno degli anfibi, che trovano nella Riserva ideali condizioni di vita: tra di essi merita una citazione il raro discoglosso dipinto (Discoglossus pictus).

Tra i rettili da segnalare infine il colubro di Riccioli (Coronella girondica), un serpente diffuso nelle campagne dell’isola, e alcune specie di testuggini terrestri (Emys orbicularis e Testudo hermanni).